Mariborski raziskovalci na sledi virusu: od množic do delcev gena

Predvsem smo veseli, da se epidemija umirja in da gredo številke navzdol, se najprej upajoče strinjajo trije mikrobiologi, del ekipe Nacionalnega laboratorija za zdravje, okolje in hrano (NLZOH), ki sodeluje pri sekvenciranju novega koronavirusa. Profesorica dr. Maja Rupnik, doc. dr. Sandra Janežič in dr. Aleksander Mahnič delajo na oddelku za mikrobiološke raziskave na NLZOH v Prvomajski v Mariboru, a raziskovalno in pedagoško delo vsi trije opravljajo tudi na Medicinski fakulteti v Mariboru. Mineva leto, odkar so mikrobiologi rekrutirani v vodilno enoto brigade znanstvenikov, ki skušajo obvladati epidemijo koronavirusa.

Poleg vrhunske znanosti in sestavljanja osnovnih kod za prepoznavanje virusa in njihovih različic raziskovalci tudi pomagajo "na rutini", ki v pritličju prvomajske procesira na tisoče PCR-testov. Tudi ti namreč niso povsem avtomatizirani, gre za precej zahteven laboratorijski sestav, ki mora biti v pogonu 24 ur na dan, vse dni v tednu. NLZOH je ena od dveh pomembnih javnozdravstvenih ustanov v državi in ima svoje laboratorije v vseh regijah. Na področju epidemije delujejo NLZOH-ovi diagnostični mikrobiološki laboratoriji, oddelek za javnozdravstveno mikrobiologijo in oddelek za mikrobiološke raziskave.

Osumljenec - preiskava - razlog za preplah

Nova varianta virusa (ne gre za sev, pravilneje jo je imenovati različica ali varianta) že kak mesec sipa v Sloveniji predvsem skrbi. Primeri so bili za zdaj odkriti le štirje, veliko več v soseščini. A zaznana je bila v Veliki Britaniji dosti prej, posamični primeri v septembru lani in nato zmeraj pogosteje oktobra in novembra. Da je v tej zgodbi človek vedno za virusom, je dejstvo, a kdaj se izve za novo različico, kdaj mikrobiologi, ki so za povrh še varuhi javnega zdravja, trikrat preberejo informacijo, zavihajo rokave in pripravijo pipete?

Maja Rupnik je prepričana, da smo v vsej covidni nesreči imeli tudi nekaj sreče: "Ko se virus dovolj namnoži, ima vedno več možnosti, da bo našel obliko, mutacijo, s katero bo bolj uspešen. Ne nujno nevarnejši, ampak bolj uspešen. Na našo srečo se to ni zgodilo bolj zgodaj v epidemiji, kar bi se načeloma lahko, recimo aprila lani. Ko se zgodi dovolj sprememb dednega zapisa, se lahko naenkrat pojavi zelo uspešna različica virusa. Na srečo se je to začelo dogajati šele zdaj. Na angleški varianti je dogajanje najpreprosteje razložiti, a v teoriji se lahko zgodi kjerkoli. Angleži so v svoji diagnostiki ugotovili nenavadne rezultate PCR-testov in ti rezultati so se pojavljali v visokem številu, ki je še naraščalo. Ko so te vzorce z nenavadnim rezultatom preverili s sekvenciranjem, so ugotovili, da so med seboj enaki in obenem drugačni od virusa, ki je sicer v populaciji."

Dalje se zgodba bere kot detektivka, osumljenec je označen kot varianta pod preiskavo (ang. variant under investigation, VUI), in ko so britanski raziskovalci raziskovali naprej, so ugotovili, da to ni muha enodnevnica, da ne gre le za večji izbruh, ampak da se natančno ta varianta pospešeno širi po Angliji. Postala je varianta zaskrbljenosti (ang. variant of concern, VOC). Izdali so mednarodno tiralico; obvestili so Svetovno zdravstveno organizacijo, Evropski center za nalezljive bolezni, Ameriški center za nalezljive bolezni. No, takrat se začne delo v laboratorijih v ostalih državah, prične se iskanje, torej sekvenciranje in spremljanje nove različice.

Zapleteno, bolj zapleteno, sekvenciranje

Vse se torej začne s tem, da se v podatkih pokaže večje število odstopanj. A variant je veliko, in če bi vsaka država sprožala alarme za vsako novo različico, bi bilo to odveč. "Angleži so bili hitri in korektni, sproti objavljajo tudi tehnična poročila. Septembra so prvič opazili dogajanje, ampak le kot lokalni izbruh, nato so podoben izbruh opazili še drugje, geografske razdalje so postajale večje, jasno je bilo, da ne gre več za lokalni dogodek," pove Rupnikova.

V Sloveniji so sekvenciranje pričeli uvajati že v prvem valu, sočasno na Inštitutu za mikrobiologijo v Ljubljani ter na dveh lokacijah NLZOH, v Mariboru in Ljubljani. V epidemiji je običajno, da pride trenutek, ko je treba pričeti z natančnimi preiskavami virusa, in takrat se začne sekvenciranje, razstavljanje in sestavljanje genov virusa in iskanje nekaj razlik med desettisoči členov zapisa. Če se zdi iskanje nevidnega virusa v velikem človeškem telesu kompleksen proces, dobrodošli v svetu sekvenciranja.

Sekvenciranje je določanje celega genoma virusa, razvozlavanje dednega zapisa virusa. Najprej izolirajo dedni material, torej genom. Dolg je 30.000 "črk", zato zapis najprej razgradijo na posamezne "besede", dolge od 100 do 200 črk. Te kratke odčitke je nato treba določiti oziroma prebrati in sestaviti nazaj v genome, opiše laboratorijski del procesa Sandra Janežič. Genom nato sestavljajo zmogljivi računalniki, ki več 10.000 teh kratkih odčitkov sestavijo nazaj v 30.000 črk dolgo zgodbo. "In v teh sestavljenih zapisih nato iščemo mutacije, v angleški različici jih je 23. Tako v drugem koraku spremembe analiziramo in določamo, na katerih mestih se genom razlikuje od prvega kitajskega virusa," pojasni Rupnikova. Šele potem lahko določijo, v katero od vej spada virus, katerega genom so izrisali.

Nekaj prednosti imajo, saj so izurjeni v sekvenciranju genomov raznih mikroorganizmov. Prav SARS-CoV-2 je ista ekipa razčlenjevala že lani spomladi, ko je raziskovalce zanimalo, katere različice virusa se sploh širijo v Sloveniji. Danes bi tisti čas, ko smo resda živeli v lockdownu, a je bilo okužb neprimerno manj, imenovali mirnodoben. Mahnič: "Šlo je za epidemiološko študijo variant, ki so takrat krožile pri nas. A na bistveno manjšem vzorcu kot danes. Vemo, da virus hitro mutira in na različne načine. Ker se razvijajo zdravila in cepiva, se je izkazalo za zelo pomembno, da se čim bolje opiše, katere različice krožijo po svetu. Tako sedaj analiziramo veliko večje vzorce kot takrat."

Presejalni testi imajo pomanjkljivosti, a v splošnem so dragoceni

Večji zalogaj je iz množice okuženih odbrati tiste, ki jih je okužila nova različica. Poznani so trije načini iskanja variant. Dva sta presejalna, torej iz množice SARS-CoV-2 pozitivnih vzorcev z nekakšnimi predtesti presejejo morebitne osumljence za novo varianto in šele nato sekvencirajo, eden pa je neposredno sekvenciranje. Če so na razpolago velike kapacitete sekvenciranja, je sledni način skoraj najboljši, pravi Rupnikova. A takih kapacitet nima prav veliko držav, zato je bolje vzorce najprej presejati. Eden od načinov presejanja je dvojno sekvenciranje, pri katerem najprej sekvencirajo le delček genoma. "To je delček za bodico, tako lahko z enim sekvenciranjem pregledaš do nekajkrat več vzorcev, kot če bi pregledal cel genom. Na enem sekvenciranju lahko pogledaš veliko število vzorcev in poiščeš le kombinacijo sprememb v genu za bodico, imenuje se S-gen. Če najdemo določeno kombinacijo sprememb, obstaja možnost, da gre za angleško različico, južnoafriško ali brazilsko različico. Vse te, za katere sumimo, da so nekaj od tega trojega, sekvenciramo v celoti. Tak postopek uporabljajo recimo v Avstriji," pojasnjuje vodja laboratorija.

Tretji način so uporabili tudi na NLZOH, in sicer s slovaškimi testi. Gre za PCR-teste, ki so pozitivni pri vzorcih, ki bi lahko bili angleška različica, ni pa to nujno. Ko je ta PCR pozitiven, je treba vse potrditi s celim sekvenciranjem. "Ta PCR presejalni test je narejen tako, da zazna eno ali dve spremembi, ki sta zelo pogosti pri angleški različici. Angleška varianta ima 23 mutacij, vsaka od teh pa se pojavi tudi pri drugih variantah. Ni prav nobenega znaka, ki bi ga imela samo angleška varianta, druge pa ne. Angleška različica pa tudi brazilska ali južnoafriška nimajo mutacije, za katero bi rekli, da točno ta določa, za katero varianto gre," zaplete uganko Rupnikova.

Mahnič vendarle doda nekaj boljših vesti: "Nekatere mutacije so vseeno bolj značilne. Ena od njih se pojavi pri vseh treh novih variantah, a jo je težko zaznati, ker ne gre za delecijo, torej manjkajočo aminokislino, ampak spremenjeno aminokislino, in prav ta je verjetno tudi odgovorna za večjo virulenco." A tudi to ne izboljša situacije, saj PCR-testi, kot je slovaški, težje zaznavajo spremenjene kot manjkajoče aminokisline, in prav ta sprememba je tista, ki jo testi težko zaznajo. "Slovaški test se je skoncentriral na dve od značilnih mutacij, saj sta tisti, ki jih PCR najlažje zazna. A te delecije so prisotne v kar velikem deležu koronavirusov, ki krožijo v Sloveniji," pravi Rupnikova. Tudi Janežičeva pri presejalnih PCR-testih ne vidi veliko možnosti za izboljšanje, tudi ko bodo na voljo presejalni PCR-testi za obe drugi pomembni varianti: "To bodo težave vseh presejalnih PCR-testov, zaznavali bodo eno ali dve mutaciji, ki kažejo, da bi lahko bila v vzorcu angleška, brazilska ali južnoafriška varianta, vseh ostalih mutacij pa ne. Zato bo v vsakem primeru potrebno potrjevanje s sekvenciranjem."

Kljub težavam so presejalni PCR-testi koristni, saj dajo rezultat že naslednji dan, ugotovijo pa vsaj, ali obstaja sum na neko varianto ali ne, kar zoža nabor vzorcev z nekaj sto na nekaj deset možnosti. Obe drugi metodi potrebujeta dva do tri tedne, kar je za epidemiološka poizvedovanja predolgo časa.

Ojačane kapacitete sekvenciranja

Kakšne so kapacitete sekvenciranja v Sloveniji? Maja Rupnik: "Trenutno zmerne, a s sodelovanjem s KISLD (Klinični inštitut za specialno laboratorijsko diagnostiko), Pediatrično kliniko, UKC Ljubljana in njihovimi sodelavci Jernejem Kovačem, Barbaro Jenko Bizjan, Marušo Debeljak, Ano Grom, Robertom Šketom, Tinetom Tesovnikom, Markom Pokornom in Tadejem Battelinom jih hitro povečujemo do predvidenih nekaj sto genomov na teden. Deloma kapacitete ponuja tudi ECDC, NLZOH pa sodeluje še z AGES v Avstriji. Kapacitete bodo tako pokrivale deset do dvajset odstotkov pozitivnih vzorcev pri sedanjih številkah okuženih."

V vsakem primeru je iskanje novih variant zelo pomembno. Gre namreč za iskanje variant, ki se izogibajo cepivu, in iskanje variant, ki bi se lahko širile v neprecepljeni populaciji, ali celo variant, ki so lahko bolj nevarne, saj povzročajo hujšo bolezen.

Izredno pomembno je, da sedaj, ko smo začeli s cepljenjem, sledimo virusu. In to počnejo mikrobiologi pravzaprav že ves čas moderne medicine nalezljivih bolezni. Mikrobiologi so na sledi mikroorganizmom ves čas, koronakriza je v njih le uperila pozornost javnosti. Med drugim je to naloga Katarine Prosenc Trilar, vodje Laboratorija za javnozdravstveno virologijo na ljubljanski lokaciji NLZOH: "​Kadar opazimo v poteku kroženja neke nalezljive bolezni spremembe (neobičajno kopičenje primerov, hitrejše širjenje, kot je običajno, težji potek bolezni, prizadetost neobičajne starostne skupine ...), skušamo ugotoviti vzrok. Vzroki so lahko zelo različni, na primer vdor mikroorganizma v pitno vodo, izbruh, povezan z množično prireditvijo ... Vedno pa pomislimo tudi na možnost spremembe mikroorganizma, ki bolezen povzroča. Pri mnogih virusih (na primer gripa, HIV) pojavljanje različnih variant spremljamo, tudi kadar ni na zunaj vidnih sprememb v delovanju virusa, saj je zgodnje odkrivanje različic lahko opozorilo za spremembe, ki so pomembne za ljudi."

Tako spremljajo vse potencialne spremembe, vse viruse in bakterije, proti katerim cepimo v Sloveniji, kar je normalen del spremljanja mikroorganizmov, ko enkrat začnemo cepiti. Rupnikova pa doda: "Vse različice mikroorganizmov, ki se pojavljajo pri nas - gripa, pnevmokoki, meningokoki ... -, lahko z mutacijami postanejo ali bolj nevarne ali pa se izognejo cepivu."